У нас уже
176407
рефератов, курсовых и дипломных работ
Сделать закладку на сайт
Главная
Сделать заказ
Готовые работы
Почему именно мы?
Ценовая политика
Как оплатить?
Подбор персонала
О нас
Творчество авторов
Быстрый переход к готовым работам
Контрольные
Рефераты
Отчеты
Курсовые
Дипломы
Диссертации
Мнение посетителей:
Понравилось
Не понравилось
Книга жалоб
и предложений
Название
Иммуноцитонимический анализ ядернык антигенов лимфоцитов человека, выявляемый с помощью моноклональнык антител
Количество страниц
104
ВУЗ
МГИУ
Год сдачи
2010
Бесплатно Скачать
23378.doc
Содержание
Содержание
Список используемых сокращений. 4
ВВЕДЕНИЕ. 5
ГЛАВА I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ «Ядерные антигены, 12 ассоциированные с пролиферацией клеток, и методы их выявления».
1.1. Понятие «клеточный цикл», его фазы, состояние 12 пролиферативного покоя («вне цикла»), принципы регуляции клеточного цикла.
1.2. Ядерные антигены пролиферирующих клеток (Ki-67, PCNA, 15 ДНК-полимераза альфа и т. д.).
1.3. Основной ядрышковый белок В23. 31 ГЛАВА П. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ. 49 ГЛАВА III. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ. 60
3.1. Подбор оптимальных иммуноцитохимических способов 60 выявления ядрышкового антигена с помощью моноклонального антитела ЗС9.
3.2. Идентификация антигена, выявляемого антителом ЗС9. 63
3.3. Изучение локализации антигена, выявляемого МКА ЗС9, в 70 динамике клеточного цикла.
3.4. Изменения в локализации В23 при стимуляции клеток к 72 пролиферации.
3.5. Исследование лимфоцитов доноров и больных с различными 82 формами лимфопролиферативных заболеваний с помощью непрямого иммунопероксидазного метода.
3.6. Получение новых гибридом, продуцирующих моноклональные 90 антитела к ядерным антигенам лейкоцитов крови человека.
ГЛАВАIV. ОБСУЖДЕНИЕ ПОЛУЧЕННЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ. 91
ВЫВОДЫ. 103
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ. 104
СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ:
ГК - гранулярный компонент
ЛПЗ - лимфопролиферативное заболевание
МКА - моноклональное антитело
ПФК — плотный фибриллярный компонент
рДНК — рибосомная ДНК
рРНК - рибосомная РНК
рРНП — рибосомные рибонуклеопротеиды
ФГА - фитогемагглютинин
ФЦ - фибриллярный центр
ЯОР - ядрышкообразующий район
Ag-ЯОР - аргентофильный ядрышкообразующий район
В-ХЛЛ — хронический В-лимфоцитарный лейкоз
ВВЕДЕНИЕ.
Актуальность темы:
Исследования клеток, проводимые методами иммуноцитохимии с использованием антител, получили очень широкое распространение как в> фундаментальной клеточной биологии, так ив повседневной клинической практике. На сегодняшний день благодаря достижениям гибридомной биотехнологии в распоряжении исследователей имеется большое количество различных моноклональных антител (МКА) - стандартных и однородных агентов, доступных для получения в лабораторных условиях в неограниченном количестве. Одной из областей их применения является изучение клеточной пролиферации, поскольку изменения в наличии или распределении различных антигенов; происходящие в клетках по ходу клеточного цикла, можно идентифицировать с помощью соответствующих антител. Помимо этого, в клинической практике количественный показатель пролиферативной активности, определяемый с помощью МКА, является важной характеристикой неопластической клеточной популяции и используется для прогнозирования течения опухолевого заболевания.
Антигенные структуры, экспрессия которых ассоциирована с клеточным циклом, могут быть локализованы на мембране и в цитоплазме, однако наибольший интерес вызывают ядерные антигены, так как основные изменения в процессе деления клеток сосредоточены именно в клеточном ядре. В мире получен ряд моноклональных антител к ядерным антигенам, ассоциированным с клеточной пролиферацией, часть из которых локализуется в особом компартменте клеточного ядра -ядрышках.
Ядрышко является обязательным структурным компонентом ядер клеток эукариот, в котором происходит синтез рибосомных РНК- и сборка
прерибосомных частиц. Изменение функционального состояния ядрышка в ходе клеточного цикла сопровождается также изменением его иммуноцитохимических особенностей, что отчетливо проявляется при использовании антител к различным ядрышковым белкам. За последние два десятилетия в результате получения и применения моноклональных антител был открыт ряд новых белков, имеющих ядрышковую локализацию^ антитела к которым нашли применение в клинической практике. Наиболее известным является* белок Ki-67, выявляющийся в поздней Gi, S, G2 и М-фазах клеточного цикла, но отсутствующий в Go-периоде (77). Кроме того, известен ряд других белков ядрышка, которые можно рассматривать в качестве возможных маркеров клеточной; пролиферации. К ним, в частности, можно отнести основной ядрышковый белок В23/нуклеофозмин, а также белки, которые участвуют в транскрипции рибосомных генов. Эти белки, как правило, обладают аргентофильными свойствами и проявляются при селективном окрашивании клеток солями серебра. Они локализуются в районе ядрышек в интерфазе и ядрышковых организаторов хромосом в митозе. Известно, что количество аргентофильных белков, определенное цитохимически на тотальных препаратах клеток или методом Вестерн-блоттинга в клеточных экстрактах, отражает способность клеток к пролиферации, закономерно изменяется be динамике клеточного цикла и является надежным цитохимическим маркером клеточного; метаболизма в целом (54, 181). Однако в литературе до сих пор отсутствуют прямые доказательства того, что локализация и количество белка В23 в клетках действительно изменяются с течением клеточного цикла, которые были бы получены с использованием антител к этому белку. В то же время, набор моноклональных антител к индивидуальным ядрышковым белкам, которые можног было бы использовать не только для изучения
фундаментальных вопросов, связанных с биогенезом рибосом, но и для решения прикладных задач, является на сегодняшний день явно недостаточным. Как правило, в распоряжении исследователей имеются аутоиммунные или поликлональные антитела к ядрышку, количество которых в силу их происхождения ограничено. В связи с этим, детальное изучение нового моноклонального антитела ЗС9, полученного в лаборатории клинической иммунологии ГНЦ РАМН (зав. лаб. - проф. Булычева Т.И.), которое направлено к ядрышковому антигену, является на сегодняшний день крайне актуальной задачей.
Цель работы:
Идентификация антигена, выявляемого новым моноклональным антителом ЗС9, а также изучение возможности использования этого антитела для анализа пролиферативной активности клеток в лабораторной и клинической практике.
Задачи работы:
1. Определить электрофоретическую подвижность и описать локализацию антигена, выявляемого моноклональным антителом ЗС9, с помощью световой иммуноцитохимии. Методом иммунопреципитации выяснить возможное соответствие ЗС9-антигена основному белку ядрышка В23/нуклеофозмину.
2. Разработать оптимальную методику для иммунофлюоресцентного и иммунопероксидазного выявления антигена с помощью антитела ЗС9 на фиксированных препаратах клеток, учитывая его принадлежность к IgM-классу иммуноглобулинов.
3. Определить качественные и количественные изменения выявляемого антигена при переходе клеток из состояния покоя к пролиферации на
модели первичной культуры донорских лимфоцитов, стимулированных фитогемагглютинином.
4. Провести сравнительный анализ динамики антигена, выявляемого антителом ЗС9, и известного маркера клеточного цикла белка Ki-67 при индуцированной активации лимфоцитов к пролиферации.
5. Оценить возможность использования антитела ЗС9 для анализа пролиферативной активности клеток в лабораторной и клинической практике при различных злокачественных заболеваниях системы крови.
Научная новизна:
Установлено, что полученное моноклональное антитело ЗС9 выявляет ядрышковый белок В23/нуклеофозмин.
Разработан оптимальный режим для иммунофлюоресцентного и иммунопероксидазного выявления белка В23 с помощью антитела ЗС9 на препаратах фиксированных клеток.
С помощью антитела ЗС9 выявлены количественные и качественные изменения в распределении В23 в лимфоцитах периферической крови человека, стимулированных к пролиферации фитогемагглютинином.
Моноклональное антитело к В23 было впервые использовано для оценки пролиферативной активности гемопоэтических клеток. Сравнительный анализ показал, что накопление белка В23 происходит уже в ранней Gi-стадии, до появления в них известного маркера пролиферирующих клеток белка Ki-67. Полученные данные указывают на то, что антитело ЗС9 позволяет выявить более ранние стадии пролиферации, чем антитело Ki-67.
Показаны статистически значимые различия (р<0,05) по экспрессии В23 в лимфоцитах здоровых лиц и больных различными лимфопролиферативными заболеваниями.
Теоретическое и практическое значение:
Полученный в лаборатории штамм гибридомных клеток ЗС9 является пригодным для создания препарата моноклонального антитела к белку В23 в лабораторном и промышленном производстве. Секретируемое им антитело может служить инструментом для фундаментальных исследований в области цитологии и молекулярной биологии. Помимо этого, оно может быть рекомендовано в качестве реагента, используемого в дополнение к существующей диагностической панели моноклональных антител для иммунофенотипирования клеток больных лейкозами и лимфомами, позволяя производить оценку пролиферативной активности патологических клеток. Иммунопероксидазная методика упрощена и адаптирована для дальнейшего широкого лабораторного использования. Отработана оптимальная методика проведения иммунофлюоресцентного окрашивания, позволяющая выявлять типичный для белка В23 характер свечения.
Положения, выносимые на защиту:
1. Моноклональное антитело ЗС9 выявляет антиген, соответствующий основному ядрышковому белку В23/нуклеофозмину, и направлено к его обеим изоформам (В23.1 и В23.2).
2. На модели стимулированной фитогемагглютинином культуры донорских лимфоцитов выявлено, что белок В23 является надежным иммунохимическим маркером последовательных стадий активации лимфоцитов человека к пролиферации. Ядрышковый белок В23 начинает выявляться в клетках раньше маркера репликативного периода - белка Ki-67.
3. На основании клинико-лабораторного анализа обследуемых лиц (30 здоровых и 70 больных с различными лимфопролиферативными заболеваниями) показана положительная корреляция между экспрессией антигенов В23 и Ki-67 (r=0,2; р<0,05). Выявлены статистически значимые различия (р<0,05) по степени экспрессии В23 в лимфоцитах здоровых лиц и больных всеми нозологическими формами лимфопролиферативных заболеваний, а также больных хроническим В-лимфолейкозом и В-лимфосаркомой.
Апробация работы состоялась на заседании проблемной комиссии «Кроветворение в норме и патологии, молекулярная биология, биотехнология» Гематологического научного центра РАМН. Материалы диссертации были доложены на Х1Ш Всероссийском симпозиуме «Структура и функции клеточного ядра» (Санкт-Петербург, октябрь 1999 г.), на Российской научно-практической конференции «Актуальные вопросы гематологии и трансфузиологии» (Санкт-Петербург, июнь 2000 г., июнь 2002 г., июнь 2004 г.), на I Всероссийском съезде гематологов (Москва, апрель 2002 г.), на научно-практической конференции «Новое в гематологии и клинической трансфузиологии» (Москва; апрель 2003 г., апрель 2004 г.), на Всероссийской научно-практической конференции «Актуальные проблемы медицинской биотехнологии» (Анапа, сентябрь 2004 г.), на Международном научном семинаре «Современная диагностика лимфопролиферативных заболеваний» (Санкт-Петербург, октябрь 2004 г.). По материалам диссертации опубликовано три статьи в центральных журналах и трое тезисов, в том числе одна статья - в зарубежной печати.
Работа выполнена в лаборатории клинической иммунологии Гематологического научного центра РАМН (зав. лаб. - проф., д.м.н. Булычева Т.И:) и в лаборатории ультраструктуры клеточного ядра сектора
электронной микроскопии Института физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского Московского Государственного Университета им. М.В. Ломоносова (зав. лаб. - д.б.н. Зацепина О.В.).
ГЛАВАI. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.
«Ядерные антигены, ассоциированные с пролиферацией клеток, и методы их выявления».
1.1. Понятие «клеточный цикл», его фазы, состояние пролиферативного покоя («вне цикла»), принципы регуляции клеточного цикла.
Изучение клеточной пролиферации как фундаментального биологического процесса, а также как специфического свойства популяции трансформированных клеток, определяющего течение злокачественного заболевания, привлекает особое внимание исследователей как в нашей стране (6, 11, 111, 169), так и за рубежом (80, 81, 145, 240). Одно из ключевых понятий, которыми оперируют исследователи пролиферации — это клеточный цикл, который также называют митотическим или пролиферативным. В настоящее время клеточный цикл удобнее всего обозначить как интервал между завершением митоза в исходной клетке и завершением митоза в ее дочерней клетке. Время, необходимое для прохождения одного клеточного цикла, получило название времени генерации. Отношение пролиферирующих клеток к общему числу клеток получило название фракции роста, или пролиферативного пула. Принципиально важным событием в изучении клеточного цикла явилось открытие дискретности репликации ДНК, что позволило разделить клеточный цикл на отдельные фазы, и положило начало его экспериментальному изучению. Было предложено разбить митотический цикл на четыре периода: собственно, деление клетки (митоз), пресинтетический период Gi, период синтеза ДНК (S) и премитотический период (G2). Вслед за тем было установлено, что в отсутствие внешних стимуляторов размножения клетка может переходить в обратимое
состояние «вне цикла» (Go), или покоя (R), где, благодаря метаболическим преобразованиям, она сохраняет жизнеспособность и пролиферативный потенциал.
После получения митогенного стимула покоящаяся клетка, прежде чем приступить к репликации ДНК, должна преодолеть некий •• «пункт ограничения», и лишь после этого она становится необратимо комитированной к синтезу ДНК. Передача сигнала от митогенов (факторов роста) в ядро клетки происходит через взаимодействие со специфическими рецепторами, расположенными на ее поверхности, которое вызывает модификацию структуры плазматической мембраны. Вследствие этого, на внутренней поверхности мембраны, возникают новые регуляторные сигналы, в передаче которых участвуют так называемые вторичные посредники (малые молекулы) и группа специфических протеинкиназ. В результате происходит активация факторов транскрипции и экспрессия «ранних» генов пролиферативного ответа, которую можно обнаружить уже через 8-10 минут после стимуляции клетки митогеном. Однако при этом инициация синтеза ДНК происходит только через длительный пререпликативный период, составляющий у позвоночных от 8 до 12 часов от момента получения митогенного сигнала до вступления клетки в S-фазу. Объяснение возникающей значительной разницы во времени было дано после того, как были открыты основные положительные регуляторы прохождения клеточного цикла - циклины, образующие комплексы с циклин-зависимыми киназами (GDKs), обнаружены их ингибиторы (CKIs) и; доказана общность молекулярно-генетического контроля пролиферации клеток у всех эукариотических организмов. Оказалось, что после получения митогенного сигнала в клетке должно произойти много событий, включающих в себя сложные преобразования и взаимодействия регуляторных молекул, прежде чем она будет в состоянии приступить к
репликации ДНК. Своевременное включение и выключение циклин-киназных комплексов и их ингибиторов обеспечивает последовательное прохождение отдельных этапов клеточного цикла и упорядоченность происходящих при этом событий. В процессе активации-инактивации регуляторных молекул принимают участие многочисленные реакции фосфорилирования-дефосфорилирования, протекающие по принципу обратной связи, а также убиквитин-зависимый и -независимый протеолиз молекул, завершивших свою функцию в том или ином пункте клеточного цикла. Такая система регулирования препятствует осуществлению более поздних событий клеточного цикла, если предыдущие еще не закончены, и делает невозможным движение процессов в обратном направлении (3).
В физиологическом отношении клеточный цикл подразумевает последовательность биохимических событий, регулируемых на генном; уровне и влекущих за собой морфологические изменения клетки (87, 122, 140, 146). Именно на идентификации молекулярных и структурных перестроек, ассоциированных с клеточной пролиферацией, основаны методы, позволяющие ее оценивать. Можно выделить несколько подходов, дающих возможность изучения клеточной пролиферации — это включение в клеточную ДНК радиоактивной метки, либо тимидиновых аналогов, например — бромдезоксиуридина, с последующим выявлением его с помощью МКА, проточная^ цитометрия с подсчетом содержания ДНК, окрашенной флюоресцентным красителем, связывание ионов серебра с ядрышковыми кислыми негистоновыми белками и иммуноцитохимическое мечение интерфазных клеток. В основе последнего метода лежит использование специфических антител, выявляющих определенные клеточные белки, количество и распределение которых меняется в ходе клеточного цикла, благодаря чему оказывается возможным идентифицировать циклирующие клетки; Антигены, ассоциированные с
клеточным циклом,, могут быть. локализованы в ядре, цитоплазме, на клеточной мембране (86), причем они могут быть экспрессированы либо в течение всех фаз клеточного цикла, исключая Go, либо в течение некоторых из них. При этом наибольшее количество работ направлено на изучение ядерных антигенов, ассоциированных с клеточным циклом, поскольку одним из главных различий между пролиферирующими и покоящимися клетками является структурно-функциональная организация их ядерного аппарата. Получение МКА, позволяющих идентифицировать данные структуры, дает возможность расширить знания о сложном процессе клеточного роста, а также применять их для практических целей - оценки пролиферативной активности патологического клона клеток при различных неоплазиях.
1.2. Ядерные антигены пролиферирующих клеток (Ki-67, PCNA, ДНК-полимераза альфа и т. д.).
Антиген Ki-67.
В мире получен ряд МКА к ядерным антигенам, ассоциированным с клеточной пролиферацией, однако одним из наиболее распространенных и широко применяемых является МКА Ki-67.
МКА К1-67 было получено в результате иммунизации мышей неочищенной ядерной фракцией клеток линии L428, происходящей из лимфомы Ходжкина (77). Начальные исследования взаимодействия этого МКА с клетками нормальных тканей, митоген-стимулированными лимфоцитами периферической крови и индуцированными к дифференцировке клетками линии HL-60 показали, что антиген Ki-67 экспрессируется в пролиферирующих, но не в покоящихся (Go) клетках (2). МКА Ki-67 выявляет на иммуноблотах две полосы с молекулярной массой 345 кДа и- 395 кДа- (76). Ген; отвечающий за экспрессию белка Ki-67,
локализован в 10 хромосоме (188), при этом цикл-зависимая экспрессия этого гена является абсолютно необходимой для осуществления клеточной пролиферации (62, 187).
К настоящему времени первичная структура, белка Ki-67 изучена достаточно подробно. В составе ее аминокислотной последовательности обнаружены потенциальные сайты фосфорилирования для различных киназ, PEST-последовательности (Pro Glu Ser Thr), имеющиеся в составе многих короткоживущих регуляторных белков, а также домен для связывания с вилкой репликации. Перечисленные структуры характерны для многих белков, участвующих в регуляции клеточного цикла, однако функция самого Ki-67 среди них остается неясной. Было показано, что Ki-67 претерпевает посттрансляционные модификации путем фосфорилирования, сопровождающиеся заметным перераспределением Ki-67 из нуклеоплазмы в перихромосомный слой и обратно в течение митоза (63, 135). Фосфорилирование и дефосфорилирование Ki-67 контролируется ключевыми регуляторными механизмами клеточного цикла и имеет место во время двух главных событий клеточного деления: распаде и реорганизации ядра в течение митоза (64).
Морфологические исследования пролиферирующих клеток показали, что антиген является компонентом ядерного матрикса (221, 222), при этом в течение клеточного цикла наблюдаются изменения внутриядерной локализации Ki-67. Так, по данным J. Isola с соавторами (96), проводивших иммуноэлектронно-микроскопическое исследование интерфазных клеток линии MCF-7, белок Ki-67 был идентифицирован, главным образом, на поверхности ядрышек, в зоне гранулярного компонента. Однако, помимо этого, слабое иммуноокрашивание было обнаружено и вне ядрышек, в плотно упакованных участка хроматина, возможно, в гетерохроматине (113). Помимо этого, Ki-67 выявляли в
области плотного фибриллярного компонента ядрышек, в котором происходят синтез и начальные стадии процессинга рибосомной РНК (рРНК) (136). В течение профазы белок Ki-67 был локализован на поверхности конденсирующихся хромосом, а в метафазе - в перихромосомном слое. Колокализация Ki-67 со структурами ядрышка, обеспечивающими созревание прерибосомных частиц, дает возможность предполагать, что он связан с метаболизмом рРНК (96).
Результаты многочисленных экспериментов: с использованием различных типов клеток показывают, что антиген Ki-67 присутствует в S, G2 и М-фазах клеточного цикла, и отсутствует в. Go- Сильное увеличение количества Ki-67-антигена наблюдается в S-фазе клеточного цикла, и оно достигает максимума в С2-М-фазах (32, 33). В постмитотических клетках происходит быстрое снижение содержания антигена (33). Так, например, на культуре ФГА-стимулированных лимфоцитов периферической крови здоровых доноров было выявлено, что антиген, связываемый МКА Ki-67, начинает выявляться в поздней Gi-стадии, и его присутствие сохраняется в S, G2 и М-фазах клеточного цикла (75). Эти данные впоследствии были подтверждены и другими исследованиями, в которых параллельно с МКА Ki-67 были использованы включение 3Н-тимидина (93) или бромдезоксиуридина (29, 81, 159, 200) в клеточную ДНК, а также проточная цитометрия (32, 120, 198).
Однако сведения, касающиеся экспрессии антигена Ki-67 в Gi-фазе, различаются. Так, клетки, которые переходят в Gj из Go под воздействием митогена, на ранних этапах не содержат Ki-67, в то время как клетки, перешедшие в Gi из митоза, всегда Ki-67-позитивны. Вследствие того, что в Gi и ранней S-фазе клеточного цикла уровень экспрессии Ki-67 довольно низкий, существует возможность идентификации таких клеток как нециклирующих (33). Однако имеются сообщения о том, что в некоторых
Список литературы
Цена, в рублях:
(при оплате в другой валюте, пересчет по курсу центрального банка на день оплаты)
1425
Скачать бесплатно
23378.doc
Найти готовую работу
ЗАКАЗАТЬ
Обратная
связь:
Связаться
Вход для партнеров
Регистрация
Восстановить доступ
Материал для курсовых и дипломных работ
29.04.24
Результаты оценки психологических детерминант гражданской идентичности учащихся старших классов
29.04.24
Программа формирования гражданской идентичности старшеклассников
29.04.24
Психологические основания для разработки программы формирования гражданской идентичности старшеклассников
Архив материала для курсовых и дипломных работ
Ссылки:
Счетчики:
© 2006-2022. Все права защищены.
Выполнение уникальных качественных работ - от эссе и реферата до диссертации. Заказ готовых, сдававшихся ранее работ.