У нас уже
176407
рефератов, курсовых и дипломных работ
Сделать закладку на сайт
Главная
Сделать заказ
Готовые работы
Почему именно мы?
Ценовая политика
Как оплатить?
Подбор персонала
О нас
Творчество авторов
Быстрый переход к готовым работам
Контрольные
Рефераты
Отчеты
Курсовые
Дипломы
Диссертации
Мнение посетителей:
Понравилось
Не понравилось
Книга жалоб
и предложений
Название
Гиперметилирование ДНК в опунолян человека
Количество страниц
92
ВУЗ
МГИУ
Год сдачи
2010
Бесплатно Скачать
23370.doc
Содержание
Содержание
Оглавление 1-3
Введение 4-5
Глава 1. Обзор литературы "Маркеры метилирования ДНК в опухолях человека"
1.1. Введение 6-7
1.2. Сигнальные пути, нарушаемые в опухолевых клетках вследствие инактивации генов гиперметилированием промоторов 7-17
1.3. Профиль гиперметилированных генов в опухолях 17-22
1.4. Методы определения статуса метилирования CpG-динуклеотидов в ДНК 22-24
1.5. Использование маркеров метилирования ДНК в клинической практике 24-27
Глава 2. Материалы и методы исследования- 28-42
2.1. Список использованных реактивов 28-29
2.2. Клинические материалы 30
2.3. Клеточные линии 30
2.4. Обработка клеточных линий деметилирующим агентом 30
2.5. Выделение ДНК 31-32
2.5.1. Одновременное выделение ДНК и РНК 31
2.5.2. Выделение ДНК из лейкоцитов 31-32
2.6. Выделение плазмидной ДНК 32
2.6.1. Выделение плазмидной ДНК методом щелочного лизиса 32
2.6.2. Выделение плазмидной ДНК на колонках 32
2.7. Обработка ДНК рестриктазами 33
2.8. Бисульфитная конверсия ДНК 33-34
2.8.1. Бисульфитная конверсия ДНК в растворе 33-34
2.8.2. Бисульфитная конверсия ДНК в агарозных бусах 34
2.9. Полимеразная цепная реакция 34-37
2.9.1. Праймеры • 35
2.9.2. Метилчувствительная ПЦР 36
2.9.3. Метилспецифическая ПЦР 36-37
2.10. Определение нуклеотидной последовательности ДНК после бисульфитной конверсии 37
2.10.1. Препаративное получение продукта ПЦР 37-38
2.10.2. Электрофорез продуктов ПЦР в агарозных гелях 38
2.10.3. Выделение продуктов ПЦР из агарозного геля 38-39
2.10.3.1. Выделение продуктов ПЦР из агарозного геля на колонках 38
2.10.3.2. Выделение продуктов ПЦР из агарозного геля на DEAE-целлюлозе 38-39
2.11. Клонирование продуктов ПЦР 39-40
2.11.1. Описание плазмид, использованных в работе в качестве вектора 39
2.11.2. Получение компетентных клеток Escherichia coli 39-40
2.11.3. Трансформация клеток Escherichia coli 40
2.12. Блот-гибридизация 40 2.12.1. Получение препаратов ДНК, меченных Р32 40-41
2.13. Реакция обратной транскрипции 41-42
Глава 3. Результаты: 43-62
3.1. Анализ метилирования CpG-островка гена RAR-p2 в опухолях шейки матки 43-3.2. Анализ метилирования CpG-островка гена TIMP-2 в опухолях шейки матки 50-
3.2.1. Анализ метилирования CpG-островка гена TIMP-2 методом блот гибридизации по Саузерну 50-52
3.2.2. Анализ метилирования CpG-островка гена TIMP-2 методом МЧ ПЦР 52-56
3.2.3. Анализ метилирования CpG-островка гена TIMP-2 методом секвенирования ДНК после бисульфитной конверсии 57-59
3.2.4. Анализ метилирования CpG-островка гена TIMP-2 методом МС ПЦР 59-61
3.2.5. Влияние деметилирующих агентов на экспрессию TIMP-2 61-63
3.2.6. Сравнение частоты метилирования генов TIMP-2 и ТШР-З в опухолях шейки матки 63
3.3. Определение статуса метилирования TIMP-2 в опухолях молочной железы 63-65
3.4. Профиль метилирования генов в опухолях шейки матки 65-69
Глава 4. Обсуждение 70-75
Выводы 76
Список литературы 77-92
ВВЕДЕНИЕ
В качестве объекта исследования в работе использовали одну из наиболее распространенных форм опухолей - рак шейки матки. По частоте заболеваемости, и смертности рак шейки матки занимает второе место, после рака молочной железы, среди всех форм опухолей у женщин. Этиологическим фактором рака шейки матки признаны вирусы папиллом человека (HPV) из так называемой группы «высокого риска» (HPV 16, 18 и родственные им, WHO, Press Release, 1996). Период от начала инфекции до возникновения опухоли может занимать несколько лет. В этот период возникают и накапливаются нарушения в функционировании клеточных генов, регулирующих такие важные для нормальной жизнедеятельности клетки процессы, как пролиферация, апоптоз, ангиогенез, поддержание генетической стабильности. Нарушение функций клеточных генов может происходить как вследствие генетических событий (мутаций), так и вследствие эпигенетических изменений (наследуемых при делении клетки изменений, не связанных с изменением последовательности ДНК). К эпигенетическим .изменениям, часто наблюдаемым в опухолях всех типов, относятся нарушения паттерна метилирования ДНК. Гиперметилированию в опухолевых клетках подвергаются специфические последовательности - CpG-островки, ассоциированные с 5' регуляторными районами многих генов. В нормальных клетках они, как правило, не метилированы. Метилирование промоторов и первых экзонов генов сопровождается подавлением их транскрипции. Таким образом, гиперметилирование 5' регуляторных районов приводит к таким же последствиям для функций генов, как и инактивирующие мутации. Исследования последних лет показали, что опухоли разных типов отличаются по набору генов, инактивируемых вследствие гиперметилирования. В связи с этим необходимо выявление маркеров аберрантного метилирования для каждого типа опухолей.
Выявление генов - потенциальных маркеров аберрантного метилирования кардинальным образом расширяет список генов, вовлеченных в канцерогенез, что в свою очередь расширяет возможности для молекулярного подхода к диагностированию, мониторингу и прогнозированию течения заболевания.
Цель настоящей работы: идентификация генов, инактивированных в опухолях шейки матки, вследствие гиперметилирования промоторов.
Исходя из цели работы, были поставлены следующие экспериментальные задачи: 1) Определить частоту метилирования в опухолях шейки матки гена рецептора
ретиноевой кислоты RARJ3-2;
2) Выяснить, связано ли наблюдаемое в опухолях шейки матки подавление экспрессии гена ТШР-2 (тканевой ингибитор металлопротеиназ 2) с метилированием 5'области гена;
3) В случае обнаружения метилирования определить район 5' области гена TIMP-2, метилирование которого коррелирует с подавлением транскрипции;
4) Определить частоту метилирования гена TIMP-2 в опухолях шейки матки;
5) Определить частоту метилирования гена TIMP-2 в другой форме эпителиальных опухолей — раке молочной железы.
Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
МАРКЕРЫ МЕТИЛИРОВАНИЯ ДНК В ОПУХОЛЯХ ЧЕЛОВЕКА.
1.1. Введение
Метилирование ДНК - это процесс энзиматического присоединения метильной группы к основаниям в составе ДНК. Эта модификация ДНК не изменяет генетического кода, однако, как, оказалось, заключает в себе дополнительную информацию, которая существенным образом может влиять на фенотип клетки.
Метилирование ДНК осуществляется ферментами - ДНК-метилтрансферазами. Основной последовательностью, которую могут узнавать и метилировать ферменты метилирования, является 5*-СрО-3'динуклеотид (Robertson et al, 2000). CpG-динуклеотиды распределены по геному неравномерно. В геноме существуют короткие (от 500 до 3000 п.н.) последовательности, где CpG-динуклеотиды распределены кластерами, плотность их близка к расчетной, а содержание C+G превышает 60%. Такие последовательности получили название CpG-островков (Bird, 1986). В остальной части ДНК CpG-динуклеотиды распределены равномерно и редко. Большая часть CpG-островков расположена в 5%-регуляторных районах генов, но они встречаются и в интронах, а также на З'-концах генов.
Большая часть CpG-островков в отличие от одиночных CpG-динуклеотидов не метилированы в нормальных клетках. Однако из этого правила есть исключения, небольшая часть CpG-островков метилирована в нормальных клетках. В тех случаях, когда наблюдается плотное метилирование (гиперметилирование) CpG-островков, оно сопровождается образованием компактной структуры хроматина в этом участке и подавлением транскрипции соответствующего гена. Таким образом, метилирование CpG-островков ограничивает транскрипционный потенциал генома (Bird, 2002). Гиперметилирование промоторных районов генов в нормальных клетках выполняет специфические функции, связанные с аллель-специфической экспрессией генов (импринтинг, инактивация хромосомы X), с подавлением экспрессии некоторых тканеспецифических генов, а также транспозонов (Li, 2002; Walsh et al, 1998; Futscher et al, 2002). Гиперметилирование некоторых генов, обычно неметилированных, наблюдается также в нормальных клетках при старении (Issa et al, 1994; Ahuja et al, 1998). Нарушение закономерностей метилирования в клетках взрослого организма наблюдается при некоторых заболеваниях человека, в том числе в злокачественных новообразованиях (Robertson et al, 2000; Jones et al, 2002). Во многих исследованных неопластических клетках наблюдается дисбаланс метилирования (рис. 1). Он выражается в широко распространенном по геному деметилировании нормально
метилированных CpG-сайтов, с одной стороны, и локальном гиперметилировании CpG-островков ДНК, с другой. В обзоре будет рассмотрен только один из наблюдаемых в опухолевых клетках типов нарушений метилирования, а именно гиперметилирование CpG-островков, ассоциированных с 5'регуляторными районами генов. Поскольку CpG-островки, ассоциированные с 5'районами генов, в большинстве своем не метилированы в нормальных тканях, то для них применимы термины - гиперметилирование, аберрантное метилирвание или просто метилирование.
1.2. Сигнальные пути, нарушаемые в опухолевых клетках вследствие инактивации генов гиперметилированием промоторов.
До недавнего времени подавляющее число исследований метилирования CpG-островков в опухолях относилось к уже известным генам. Во многих типах опухолей была обнаружена инактивация путем аберрантного метилирования CpG-островков известных генов-супрессоров опухолевого роста и метастазирования, генов системы репарации ДНК и генов, вовлеченных в регуляцию апоптоза и ангиогенеза. В таблице 1 приведены основные сигнальные пути, которые, как известно, часто нарушаются в опухолевых клетках. Эти сигнальные пути были выявлены благодаря исследованиям генетических механизмов нарушения функций генов, вовлеченных в канцерогенез. Оказалось, что многие гены-участники этих сигнальных путей могут быть инактивированы с помощью альтернативного мутациям механизма — метилирования 5'регуляторного района. В таблице 1 приведены примеры таких генов.
Ген ретинорбластомы (Rb)- первый классический ген-супрессор, для которого было обнаружено метилирование его промотора в опухолях. Предполагается, что почти все антипролиферативные сигналы реализуются в клетке опосредовано через белок pRb или родственные ему белки р107 и р130 (Hanahan et al, 2000). Примерно в 10-15% случаев спорадической (односторонней) ретинобластомы имеет место гиперметилирование CpG-островка промотора гена Rb. Эпигенетический механизм инактивации Rb имеет место только при этой форме опухоли. В большинстве остальных случаев (а инактивация Rb отмечена при многих формах рака) механизм иной - мутации и делеции гена, что подтверждает одинаковый функциональный итог этих изменений (Greger et al, 1989).
Сигнальный путь Гены
Регуляция клеточного цикла Rb, INK4A, FHIT
Регуляция апоптоза PTEN, DAP-киназа, TIMP-3
Регуляция ангиогенеза THBS1, VHL, T1MP-3
Репарация повреждений ДНК и защита от повреждений ДНК hMLH-1, MGMT, GST-Ti
Регуляция адгезивных взаимодействий, подвижности и протеолитической активности клеток E-KadxepuHiCDHl), TIMP-3
Ответ на факторы, регулирующие рост и дифференцировку RAR/3-2, SOCS
INK4A
Ген INK4A кодирует конститутивно экспрессируемый ингибитор циклин-зависимых киназ. Белок р16Ш1С4А играет ключевую роль в контроле клеточного цикла. Связываясь с циклин-зависимыми киназами CDK4 и CDK6, pl6[NIC4A блокирует сигнальный путь cyclin D-Rb. Утрата этого белка или его инактивация приводит к нарушению клеточного цикла. Циклин-зависимые киназы фосфорилирует pRb, в результате чего из неактивного комплекса с Rb высвобождается фактор транскрипции E2F. В итоге активируются гены, обусловливающие вхождение клетки в фазу S цикла. Функциональная потеря pl6INK4A часто имеет место в различных первичных опухолях и производных клеточных линиях вследствие потери гетерозиготности и соматической мутации оставшегося аллеля или гомозиготных делеций (Nobori et al, 1994).
Было показано, что часто потеря экспрессии гена INK4A в отсутствие делеций коррелирует с гиперметилированием CpG-островка в 5'-области гена. Метилирование гена INK4A составляет, по разным данным, от 20 до 67 % в опухолях человека разной локализации: в глиомах, в опухолях мочевого пузыря, молочной железы, толстого кишечника, пищевода, головы и шеи, легкого, ротоглотки, яичника и других (Baylin et al, 1998).
Метилирование INK4A наблюдается в предопухолевых поражениях бронхов, легкого, желудка, что указывает на то, что оно является ранним и важным событием в канцерогенезе. Было показано также, что метилирование INK4A в нормальной ткани легкого ассоциировано с курением, что рассматривается как фактор риска развития заболевания (Kim et al, 2001; Lamy et al, 2002; Jang et al, 2001).
FHIT
FH1T- (fragile histidine triad) - белковый продукт гена - АРЗА гидролаза, которая расщепляет субстрат АР4А; АР4-молекула, которая вовлечена в контроль клеточного цикла и репликации ДНК. FHIT - предполагаемый негативный регулятор клеточного цикла. Отсутствие или снижение уровня мРНК, а также неполноразмерные транскрипты этого гена обнаружены во многих типах опухолей, в том числе при раке шейки матки. Мутации, аллельные и гомозиготные делеции гена FHIT были показаны в нескольких типах опухолей (Zou et al, 1997; Negrini et al, 1996; Gemma et al, 1997; Thiagalingam et al, 1996). Метилирование 5'CpG-островка FHIT, сопровождающееся инактивацией транскрипции, наблюдается в различных типах опухолей: опухолях мочевого пузыря, шейки матки, пищевода, легкого, молочной железы, простаты,
ротовой полости, яичка (Maruyama et al, 2001; Wu et al, 2003; Kuroki et al, 2003; Zochbauer-Muller et al, 2001; Maruyama et al, 2002; Chang et al, 2002; Honorio et al,2003).
DAPK
DAPK (от англ death-associated protein kinase) - ген киназы белков, ассоциированных с апоптозом. Продукт гена - регулятор апоптоза, индуцируемого у-интерфероном (IFN-y), TNF-a, активацией Fas рецептора или утратой контакта с экстрацеллюлярным матриксом. (Cohen et al, 2001) Во многих клеточных линиях белок и мРНК DAP киназы часто отсутствуют. Во многих опухолях наблюдается метилирование промотора гена, сопровождающееся подавлением транскрипции. Метилирование промотора гена DAPK было обнаружено при множественной миеломе, в опухолях легкого, мочевого пузыря, головы и шеи, носоглотки (Margaret et al, 2001; Kim et al, 2001; Tada et al, 2002; Hasegawa et al, 2002; Wong et al, 2002).
PTEN
PTEN (MMAC1) - ген кодирует протеин/липидную фосфатазу. Продукт гена индуцирует апоптоз, подавляя активность Р[ЗК-РКВ/Ак] сигнального пути. Возможно, продукт PTEN вовлечен также в регуляцию клеточной адгезии, миграции и дифференцировки (Tamura et al, 1998). Многие опухоли характеризуются мутациями PTEN и аллельной потерей большого хромосомального района, в котором картирован ген PTEN (10q23). Полная утрата функций Pten ассоциирована с поздними стадиями прогрессии опухолей и метастазированием (Li et al, 1997; Steck et al, 1997; Cairns et al, 1997). Метилирование промотора гена обнаружено во многих типах опухолей: глиобластомах, гепатокарциномах, опухолях легкого, желудка, матки (Baeza et al, 2003; Schagdarsurengin et al, 2003; Soria et al, 2002; Kang et al, 2002; Salvesen et al, 2001).
TIMP-3
Ген TIMP-3 (tissue inhibitor of metalloproteinase-3) - тканевой ингибитор матриксных металлопротеиназ 3, относится к семейству ингибиторов матриксных металлопротеиназ (ММР), включающему еще 3 гена: TIMP-1, TIMP-2 и TIMP-4. Продукты этих генов играют ключевую роль в поддержании гомеостаза экстрацеллюлярного матрикса за счет регуляции активности ММР. ММР играют активную роль в инвазии и метастазировании опухолей: их повышенная экспрессия и активность ассоциированы со злокачественными превращениями опухолевых клеток. Снижение экспрессии TIMP может также приводить к увеличению активности ММР и
увеличению злокачественного потенциала опухолевых клеток (Jiang et al, 2002; Seo et
al, 2003). Ингибирующая способность генов семейства Т1МР> таким образом, играет важную роль на поздних стадиях прогрессии опухоли. Однако гены семейства TIMP — полифункциональные белки, и помимо их способности ингибировать различные ММР, они обладают и другими функциями, по которым члены семейства отличаются друг от друга. Они по-разному влияют на клеточную пролиферацию, апоптоз и ангиогенез, таким образом, оказывая влияние на выживаемость опухолевх клеток и ранние этапы становления опухоли (Jiang et al, 2002). Эти эффекты могут проявляться через ММР-зависимый и независимый пути. TIMP-3 - единственный из всех членов семейства обладает проапоптотическими свойствами. Он способен индуцировать апоптоз при экзогенной экспрессии в опухолевых клетках, а также подавлять рост, инвазию и ангиогенез в первичных опухолях (Ahonen et al, 1998; Anand-Apte et al, 1996; Bian et al, 1996).
Метилирование промотора TIMP-3, сопровождающееся подавлением транскрипции гена, было показано для клеток опухолей толстого кишечника и желудка в культуре, затем для первичных опухолей почки и мозга, где метилирование гена сопровождалось подавлением экспрессии белка (Bachman et al, 1999; Kang et al, 2000). TIMP-3 часто метилирован также в опухолях легкого, поджелудочной железы, желудка и нейрофибромах (Zochbauer-Muller et al, 2001; Wild et al, 2003; Kang et al, 2003; Gonzalez-Gomez et al, 2003). В некоторых случаях метилирование TIMP-3 было обнаружено в предраковых новообразованиях, и частота метилирования гена возрастала с прогрессией от предраковых новообразований к карциномам желудка (Kang et al, 2001). Частота метилирования гена коррелировала с метастазированием в опухолях поджелудочной железы (Wild et al, 2003).
THBS1
THBS1 (thrombospondin-1) - ген, который кодирует ингибитор ангиогенеза тромбоспондин 1. Экспрессируется во многих тканях и регулируется продуктами генов р53и Rb. Thbsl ингибирует адгезию, рост и подвижность клеток эндотелия сосудов в ответ на ангиогенные стимулы. Снижение экспрессии THBSI отмечено во многих опухолях, а его реэкспрессия в клетках рака молочной железы замедляет рост опухоли, ангиогенез и метастазирование. До сих пор не обнаружено мутаций, делеций или транслокаций этого гена в опухолях человека. Метилирование CpG-островка и сопряженная с этим инактивация THBS1 отмечена в глиомах и нейробластоме (Li et al, 1999; Yang etal, 2003).
MGMT
MGMT- (от англ. O6-methy]guanine-DNA methyltransfrase) - продукт гена MGMT-фермент, который репарирует ДНК, удаляя метальные и алкильные радикалы из 0-6 позиции гуанина в ДНК. Об-метилгуанин способен образовывать водородные связи с тимином, что приводит после репликации ДНК к замене пары Г:Ц на А:Т. О6 -алкилгуанин может образовывать сшивки с цитозином в противоположной цепи ДНК, блокируя репликацию. Удаляя метальные и алкильные аддукты из ДНК, фермент защищает клетки от канцерогенного и цитотоксического действия алкилирующих агентов. Способность клеток противостоять воздействию таких агентов прямо зависит от числа молекул фермента (Pegg AE, 1990). В нормальных клетках при снижении уровня MGMT повышается чувствительность к мутагенному эффекту канцерогенов, равно как и к цитотоксическому. Опухолевые клетки с дефицитом MGMT приобретают еще одно важное свойство - чувствительность к терапии алкилирующими агентами.
В опухолях с подавленной экспрессией MGMT, как правило, отсутствуют, как белок, так и мРНК, а делеции и реаранжировки и точечные мутации гена встречаются крайне редко, что указывает на эпигенетическую природу подавления экспрессии (Pieper et al, 1990). Действительно, метилирование промотора в опухолях со сниженной экспрессией MGMT было обнаружено в значительном проценте случаев при раке легкого, толстого кишечника, печени, желудка, в опухолях головы и шеи, в глиомах и лимфомах (Costello et al, 1994; Esteller et al, 1999; Zhang et al, 2002; Oue et al, 2001).
hMLH1
hMLHl - продукт этого гена участвует в репарации неспаренных оснований, возникающих как следствие ошибок репликации ДНК. Его мутации обнаруживают у больных наследственным неполипозным раком толстой и прямой кишки, а также спорадической формой рака этой локализации. Инактивация hMLHl ведет к накоплению мутаций в коротких повторяющихся (микросателлитных) последовательностях. Потеря функциональной активности этого гена часто вызвана метилированием его CpG-островка (Strathdee et al,1999). Было установлено, что микросателлитная нестабильность при спорадической форме рака толстого кишечника, эндометрия и желудка в большинстве случаев обусловлена именно этой причиной (Herman JG, 1999).
GST-7i{GSTP1)
Глютатион-S- трансфераза-л относится к семейству глютатион-S- трансфераз -ферментов, которые защищают клетки от повреждений ДНК электрофильными канцерогенами, катализируя их конъюгацию с глютатионом. Ген глютатион-S-трансферазы-тс метилирован и его транскрипция угнетена практически во всех исследованных случаях первичного рака предстательной железы, где он является наиболее постоянным маркером (Lee et al, 1994). Метилирование GST-л обнаружено также при раке молочной железы, почек, печени (Zhong et al, 2002).
Е-кадхерин [CDH1)
Е-кадхерин (CDH1) — член семейства генов трансмембранных гликопротеинов, белковый продукт гена участвует в межклеточных контактах, инициирует передачу сигналов, активирующих р53 и р27 ^'(негативный регулятор клеточного цикла). Ассоциация рядом расположенных эпителиальных клеток посредством мостика из молекул Е-кадхерина инициирует антиростовой сигнал. Е-кадхерин рассматривается как супрессор инвазии и метастазирования в карциномах. Мутации гена в половых клетках наблюдается при наследственных формах рака желудка, а также при спорадических формах рака желудка и др. Снижение экспрессии Е-кадхерина коррелирует с приобретением инвазивного фенотипа клетками рака различных органов человека(Ровенский,1998).
Во многих опухолях человека наблюдается метилирование Е-кадхерииа: опухоли простаты, молочной железы, щитовидной железы, почки, печени, шейки матки, ротовой полости (Kanai et al, 1997; Graff et al, 1998; Viswanathan et al, 2003; Graff et al, 1995; Chang et al, 2003; Chen et al, 2003).
SOCS
SOCS (от англ. the suppressor of cytokine signaling - супрессор сигнальных путей, активируемых цитокинами) - ингибитор сигнального пути JAK/STAT (JAK - Janus kinase; STAT - signal transducers and activators of transcription), потенциальный опухолевый супрессор. Этот сигнальный путь играет важную роль в регуляции клеточного роста, дифференцировки и гематопоэза. Нарушение JAK/STAT пути наблюдается во многих опухолевых клетках.
Семейство SOCS включает 8 белков, которые ингибируют JAK/STAT сигнальный путь с помощью разных механизмов. На модельных системах было показано, что восстановление транскрипции SOCS-3 приводило к подавлению активности STAT3,
индукции апоптоза и подавлению роста клеток. Для двух членов семейства (SOCS-1, SOCS-3) показано, что подавление экспрессии в опухолевых клетках коррелирует с метилированием их промоторов. Метилирование промоторов обнаружено в опухолях печени, опухолях легкого, множественных миеломах (Okochi et al, 2003; Galm et al, 2003; Nagai et al, 2003). SOCS-3, как было обнаружено недавно, метилирован в клеточных линиях опухолей легкого, молочной железы, мезотелиомы (Не et al, 2003).
Таким образом, подавление транскрипции SOCS-3 за счет метилирования его промотора является одним из важных механизмов активации JAK/STAT пути в патогенезе опухоли.
RAR/3-2
Ген RARJ3 относятся к суперсемейству ядерных рецепторов, являющихся лиганд-активируемыми транскрипционными факторами (Chambon, 1994). Лигандами для рецепторов класса RAR (от англ. retinoic acid receptor) являются ретиноиды - витамин А и его биологически активные метаболиты. Известно, что ретиноиды способны ингибировать пролиферацию клеток и индуцировать клеточную дифференцировку. В связи с этим их используют для терапии и предотвращения развития различных опухолей (Hong et al, 1994; Behbakht et al, 1996).
Класс рецепторов RARp включает три субтипа RARa, RARP и RARy. При действии лиганда рецепторы класса RAR образуют гетеродимерные комплексы с RXRs (ретиноидные рецепторы класса X). Эти комплексы активируют транскрипцию за счет связывания с ретиноид-респонсивными элементами (RAREs), локализованными в промоторных участках генов-мишений (Chambon, 1994). Одной из мишеней для ретиноидных рецепторов является сам ген RARp. Ген RARp кодирует четыре транскрипта и экспрессируется в нормальных эпителиальных тканях, где его экспрессия может увеличиваться в ответ на обработку ретиноевой кислотой (RA) (de The et al, 1989; de The et al, 1990). Было обнаружено, что во многих клеточных линиях, полученных из различных опухолей человека, уровень мРНК гена RARp-2 (одного из четырех транскриптов этого гена) снижен или вообще не определяется: клеточные линии рака легкого, эпителиального рака яичников, рака молочной железы, рака простаты, рака желудка, рака шейки матки (Nervi et al, 1991; Virmani et al, 2001; Swisshelm et al, 1994; Caliaro et al, 1994; Yang et al, 2002; Bovenzi et al, 2001; Sirchia et al, 2000; Yang et al, 2001; Nakayama et al, 2001; Yamanaka et al, 2003; Hayashi et al, 2001; Xu etal, 1999).
Снижение уровня мРНК гена RAR/3-2 (по сравнению с нормальными тканями) было обнаружено также в первичных опухолях шейки матки, молочной железы (Comerci et al, 1997), в опухолях головы и шеи (Xu et al, 1994; Lotan et al, 1995), легкого, желудка и предзлокачественных поражениях ротовой полости (Lotan et al, 1995; McGregor et al, 2002).
Все эти факты указывают на то, что специфическое снижение экспрессии RARJ3-2 может быть важным событием в канцерогенезе. В пользу этого предположения говорят эксперименты с клеточными культурами, где было показано, что RAR/i-2 может функционировать как опухолевый супрессор. Экзогенная экспрессия гена RARfi-2 в различных опухолевых линиях клеток, негативных по RAR.p-2, подавляет их рост при обработке ретиноевой кислотой. Постоянная экспрессия антисенс-РНК RAR/3 в клетках карцином, экспрессирующих RAR(3 снижает чувствительность к ингибирующему рост эффекту ретиноевой кислоты (Sun et al, 2000). Подавление роста клеток при экзогенной экспрессии RAR/3-2 сопровождается остановкой клеточного цикла в G1 фазе и индукцией апоптоза (Seewaldt et al, 1995; Liu et al, 1996). Таким образом, дефицит экспрессии RARJ3-2 помогает опухолевой клетке избежать контроля за ростом, индуцируемомого ретиноевой кислотой.
Механизм подавления экспрессии RAR.p-2 в опухолевых клетках до сих пор окончательно не выяснен, однако в последнее время появились доказательства того, что одним из механизмов инактивации гена является метилирование его промотора. Хорошо известно, что не во всех Л4/?/?-2-негативных клеточных линиях карцином удается индуцировать его экспрессию при обработке ретиноевой кислотой (Yang et al, 2002). В одной из таких клеточных линий, полученной из карциномы толстого кишечника, удалось восстановить индукцию RAR/3-2 под действием ретиноевой кислоты после предварительной обработки клеток деметилирующим агентом - 5-аза-2'-дезоксицитидином, что наводило на мысль о метилирование его промотора в этих клетках (Cote et al, 1998). Действительно, метилирование промотора и 1 экзона RAR/3-2, сопровождающееся подавлением транскрипции гена, было затем показано для клеточных линий, полученных из карцином молочной железы, толстой кишки, желудка, пищевода, простаты, легкого, шейки матки (Widschwendter et al, 2001; Cote et al, 1998; Hayashi et al, 2001; Kuroki et al, 2003; Nakayama et al, 2001; Virmani et al, 2000; Virmani et al, 2001). Метиллирование промотора RAR/3-2 оказалось частым событием также во многих первичных опухолях человека: опухолях легкого, желудка, простаты, поджелудочной железы, пищевода, двенадцатиперстной кишки, молочной железы,
Список литературы
Цена, в рублях:
(при оплате в другой валюте, пересчет по курсу центрального банка на день оплаты)
1425
Скачать бесплатно
23370.doc
Найти готовую работу
ЗАКАЗАТЬ
Обратная
связь:
Связаться
Вход для партнеров
Регистрация
Восстановить доступ
Материал для курсовых и дипломных работ
29.04.24
Результаты оценки психологических детерминант гражданской идентичности учащихся старших классов
29.04.24
Программа формирования гражданской идентичности старшеклассников
29.04.24
Психологические основания для разработки программы формирования гражданской идентичности старшеклассников
Архив материала для курсовых и дипломных работ
Ссылки:
Счетчики:
© 2006-2022. Все права защищены.
Выполнение уникальных качественных работ - от эссе и реферата до диссертации. Заказ готовых, сдававшихся ранее работ.