У нас уже
176407
рефератов, курсовых и дипломных работ
Сделать закладку на сайт
Главная
Сделать заказ
Готовые работы
Почему именно мы?
Ценовая политика
Как оплатить?
Подбор персонала
О нас
Творчество авторов
Быстрый переход к готовым работам
Контрольные
Рефераты
Отчеты
Курсовые
Дипломы
Диссертации
Мнение посетителей:
Понравилось
Не понравилось
Книга жалоб
и предложений
Название
Исследование структуры актинопоринов актиний Oulactis orientalis и Eadianthus macrodactylus
Количество страниц
95
ВУЗ
МГИУ
Год сдачи
2010
Содержание
Содержание
Список сокращений...3
Введение...4
2. Литературный обзор...5
2.1. Классификация пороформирующих токсинов (ПФТ)...5
2.2. Структура и механизм действия а-пороформирующих токсинов...8
2.2.1. Колицин...8
2.2.2. Актинопорины...11
2.2.2.1. Первичная структура актинопоринов...13
2.2.2.2. Вторичная и третичная структура актинопоринов...15
2.2.2.3. Механизм действия актинопоринов...18
2.3. (З-Пороформирующие токсины...22
2.3.1. Холестеринзависимые цитолизины...22
2.3.2. Стафилококковый сс-гемолизин...27
2.3.3. Антиген сибирской язвы...29
2.4. Пороформирующие антимикробные пептиды...31
2.4.1. Механизм трансмембранного действия антимикробных пептидов...33
2.4.2. Секропины...35
2.4.3. Магаинины...38
2.4.4. Дермасептины...38
2.4.5. Мелиттин...39
2.4.6. Аламетицин...42
2.4.7. Пардаксин...44
2.5. Заключение...45
3. Результаты и обсуждение...48
3.1. Поиск биологически активных полипептидов в актиниях
Японского и Охотского морей...48
3.2. Выделение и физико-химические свойства актинопоринов из О. orientalis...52
3.3. Структура актинопоринов актиний О. orientalis и R. macrodactylus...62
3.3.1. Установление Л^-концевой аминокислотной последовательности актинопоринов Ог-АиОг-G...63
3.3.2. Установление полной аминокислотной последовательности актинопоринов О. orientalis...65
3.3.3. Установление полной аминокислотной последовательности...72
Radianthus актинопорина RTX-A...72
3.3.4. Исследование структурно-функциональных взаимосвязей актинопоринов...76
4. Экспериментальная часть...86
4.1. Материалы...86
4.2. Методы...87
5. Выводы...94
6. Литература...95
Список сокращений
Aib — аминоизомасляная кислота
IPTG - изопропил-Р-1)-тиогалактопиранозид
MALDI-TOF - матрично-активированная лазерная десорбция/ионизация с
использованием время-пролетного анализатора
pdb — белковая база данных
pi - изоэлектрическая точка
rsmd — среднеквадратичное отклонение
X-Gal - 5-бром-4-хлор-3-индолил-Р-?>-галактопиранозид
а.о. — аминокислотный остаток
БЛМ - бислойные липидные мембраны
ГЛПа - глицин-лейциновый пептид в амидной форме
ЗА — защитный антиген
ЛФ — летальный фактор
ОФ - отечный фактор
п.о. — пара олигонуклеотидов
ПЦР - полимеразная цепная реакция
ПФО - перфринголизин О
ПФТ- пороформирующие токсины
ТМН - трансмембранный регион
ХЗЦ — холестеринзависимые цитолизины
ФПК — фрагмент предшественника ксенопина
ФПС - фрагмент предшественника каерулина
Введение
Одной из фундаментальных задач физико-химической биологии является выяснение молекулярных основ функционирования биологических мембран, выполняющих ряд важнейших для клеток функций. Мембрана является границей раздела в клеточной компартментализации, через нее осуществляются контакты клеток друг с другом и с окружающей средой, она также защищает клетку от действия агрессивных факторов окружающей среды. Важное направление в современных исследованиях составляет изучение механизмов транспорта ионов и метаболитов через мембраны, липид-белковых и белок-белковых взаимодействий в мембране, играющих ключевую роль в ряде биологических процессов. Многие из этих процессов жизненно важны для клеток, а некоторые из них ответственны за их гибель. Общепризнанными и универсальными инструментами в этих исследованиях являются а- и (3-пороформирующие токсины (ПФТ), группа цитолитических полипептидов и белков, продуцируемая как прокариотическими, так и эукариотическими клетками. ПФТ многих бактерий являются инвазивными факторами ряда опасных заболеваний, что и предопределяет необходимость всестороннего изучения их структуры и механизма действия.
Наиболее изученными представителями ПФТ, наряду с холестеринингибируемыми цитолизинами грамположительных бактерий, являются сфингомиелинингибируемые цитолизины актиний — актинопорины. Уникальная пространственная организация и способность формировать в мембранах поры лежат в основе антиопухолевой, кардиостимулирующей, антипаразитарной и других видов биологической активности актинопоринов, т.е. ПФТ являются перспективными соединениями для создания новых лекарственных препаратов.
Настоящая работа является частью исследований, проводимых в Тихоокеанском институте биоорганической химии ДВО РАН по изучению структуры и функции биологически активных полипептидов актиний. Данная работа посвящена поиску, изучению физико-химических свойств, установлению структурно-функциональных взаимоотношений актинопоринов тропической актинии Radianthus macrodactylus и актинии Японского моря Oulactis orientalis.
5 2. Литературный обзор
Цитолитические токсины белковой природы продуцируют бактерии, насекомые, ядовитые рептилии, жалящие морские беспозвоночные. К настоящему времени охарактеризовано более 300 белковых токсинов и, по крайней мере, треть из них действует, разрушая клеточные мембраны [1]. Многие из этих токсинов формируют поры в клеточных мембранах, что приводит к дезорганизации их структуры и, в конечном итоге, к потере морфологической и функциональной целостности клеток (рис. 1). Поэтому в настоящее время токсины, обладающие мембранолитическим действием, принято называть пороформирующими токсинами (ПФТ).
2.1. Классификация пороформирующих токсинов (ПФТ)
Современная классификация ПФТ основана на характерных структурных особенностях, в соответствии с которыми их делят на а- и р-ПФТ. Установлено, что в образовании пор а-ПФТ участвуют в основном а-спиральные участки молекулы. Такие токсины имеют тенденцию к а-спирализации. Поры формируются доменами, а-спиральными шпильками, расположенными в середине трехслойной молекулы, состоящей до десяти а-спиралей. Предполагается, что эти шпильки ответственны за начальные стадии проникновения токсина в мембрану. Типичными представителями этого класса являются пороформирующие колицины Escherichia coli [2], экзотоксин из Pseudomonas aeruginosa [3], некоторые инсектицидные 5-эндотоксины (из двух мультигенных семейств Cry и Cyt) из Bacillus thuringiensis [4] и дифтерийный токсин из Corynebacterium diphtheriae [5] (рис. 2).
Относящиеся к группе Р-ПФТ полипептиды, в отличие от высоко спирализованных а-ПФТ, представляют собой многодоменные структуры с преобладанием р-баррельного типа. В этот класс входят аэролизин [6], а-гемолизин из Staphylococcus aureus [8], цитотоксин из Pseudomonas aeruginosa [6], антиген сибирской язвы [9], семейство холестеринзависимых цитолизинов [10]. До сих пор мало известно о том, как токсины этого класса включаются в мембрану, хотя согласно последним
исследованиям предполагается, что они имеют общий механизм взаимодействия с мембраной [11].
Бактериальная клетка - продуцент токсина
Связывание токсина с
поверхностью
клетки-мишени
Олигомеризация молекул токсина на поверхности клетки-мишени
Внедрение в клеточную мембрану
Рис. 2. Ленточная диаграмма структур некоторых представителей а-ПФТ [6]. Темным цветом выделены участки молекул, ответственные за пороформирующую активность токсинов. (А) Колицин 1а из Е. coli [7]. (Б) Экзотоксин А из P. aeruginosa [3]. (В) Cry инсектицидный 8-эндотоксин из В. thuringiensis [4]. (Г) Дифтерийный токсин из С. diphtheriae [5].
2.2. Структура и механизм действия сс-пороформирующих токсинов
а-ПФТ, продуцируемые различными видами живых организмов, действуют на клетки бактерий, насекомых, млекопитающих [6]. Мало похожие на первый взгляд структуры всех а-ПФТ имеют высоко а-спирализованные домены (рис. 2). Предполагается, что за каждый этап взаимодействия с мембраной, а именно, связывание с рецептором, транслокационное внедрение в мембрану, а также токсическое действие, отвечают определенные домены [6]. В доменах а-ПФТ, ответственных за формирование пор, может присутствовать как одна (например, у эквинатоксинов), так и несколько а-спиралей (так называемый пучок). Этот пучок имеет трехслойную структуру, состоящую из 6-10 а-спиралей, где каждый слой сформирован с помощью одной/двух или более антипараллельных а-спиралей, некоторые из которых полностью спрятаны внутри пучка.
Первоначальное взаимодействие токсина с мембраной включает «распластание» пучка а-спиралей полипептида на поверхности мембраны. Проникновение в липидный слой сопровождается изменением конформации молекулы. Несмотря на близкий механизм порообразования у всех а-ПФТ, подобия в аминокислотной последовательности пороформирующих доменов не обнаружено [6].
2.2.1. Колицин
Типичным представителем а-ПФТ является колицин А, на примере которого был продемонстрирован механизм действия а-ПФТ [12, 13]. Полипептидная цепь колицина А состоит из 204 а.о., которые образуют 10 а-спиралей, формирующих трехслойную структуру (рис. ЗА). Установлено, что восьмая и девятая а-спирали находятся внутри трехмерной структуры [12]. На основании этой структурной особенности молекулы была предложена «зонтичная» модель проникновения токсина в мембрану. Согласно этой модели гидрофобная петля шпильки, состоящей из восьмой и девятой а-спирали, инициирует взаимодействие токсина с липидным бислоем путем полного внедрения в
него (рис. 3 Б) [13]. Проникновение заряженных аминокислотных остатков в мембрану энергетически невыгодно, внедрение шпильки в мембрану инициирует такое конформационное изменение молекулы, при котором, два внешних, обрамляющих восьмую и девятую а-спирали слоя, остаются вне мембраны (подобно раскрытому зонтику). При этом их гидрофобные внешние стороны оказываются расположенными на поверхности бислоя (рис. ЗБ) [13].
«Зонтичная» модель была тщательно проверена экспериментально. Методом цистеин-сканирующего мутагенеза было показано, что введение дисульфидных связей между 1 и 9, 5 и 6, 9 и 10 а-спиралями приводит к инактивации токсина, так как молекула теряет способность раскрываться в виде зонтика [14]. Методами флуоресцентной спектроскопии было установлено, что гидрофобная шпилька, образуемая 8 и 9 а-спиралями глубоко погружается в липидный бислой, тогда как амфифильные 1-7 и 10 а-спирали располагаются на поверхности мембраны [15]. Последующие конформационные изменения затрагивают все гидрофобные шпильки, образуемые 3, 4, 5, 6 и частично 7 а-спиралями, что приводит к дальнейшему включению их в липидный бислой (рис. ЗВ) [16, 17].
По-видимому, положительный заряд аминокислотных остатков а-спиралей, кольцом окружающих гидрофобную шпильку, играет важную роль в первоначальном электростатическом взаимодействии колицина А с отрицательно заряженными липидами мембран и в ориентации молекулы, необходимой для внедрения шпильки в мембрану [18]. Кроме того, важным для конформационных перестроек молекулы колицина А, происходящих при включении ее в мембрану, является наличие остроконечных полостей в белковом коре (рис. ЗА) [12].
Установлено, что формирующий пору домен колицина А переходит в состояние расплавленной глобулы, при этом разрушается его третичная структура, но сохраняется вторичная [19, 20]. В промежуточном состоянии расплавленной глобулы уменьшается энергетический барьер для «раскрытия» гидрофобной шпильки при ее встраивании в мембрану [21]. Данное состояние молекулы инициируется низким значением рН на поверхности мембран, содержащих кислые липиды.
Рис. 3. «Зонтичная» модель взаимодействия пороформирующего домена колицина А с мембраной. А: Токсин приближается к мембране. Б: «Зонтичная» конформация в закрытом состоянии канала. В: Предполагаемая конформация открытого состояния канала. Эта модель допускает олигомеризацию или образование белок-липидной поры. Для простоты показан только один мономер [6].
Показано, что мутантная форма колицина А, у которого отсутствуют 1 и 3 а-спирали, полученная усекающим мутагенезом, также обладает порообразующей активностью [22]. С помощью сайт-направленного мутагенеза колицина А установлено, что для формирования канала важны 5 и 9 а-спирали молекулы [23]. Изучение пороформирующей активности природного и расщепленного протеазами колицина показало, что каналы мутантных форм состоят максимум из 6 а-спиралей [2]. Ряд авторов [24, 25] отмечает трудность в согласовании предлагаемой модели с экспериментальными данными, указывающими на наличие дискретных каналов с диаметром в 10 А, которые образует токсин.
2.2.2. Актинопорины
Одним из наиболее изученных классов а-ПФТ являются цитолитические токсины, продуцируемые актиниями [26]. По мнению исследователей, они синтезируются и локализуются вместе с другими компонентами ядовитого секрета в нематоцистах [27].
Наиболее многочисленную и хорошо изученную группу цитолизинов, выделенных в основном из тропических видов актиний, составляют полипептиды с молекулярной массой 15-20 кДа [26, 28, 29-32]. Благодаря своей способности образовывать поры в биологических мембранах они получили название актинопорины [26]. В таблице 1 приведены физико-химические характеристики некоторых актинопоринов актиний Stichodactyla helianthus [33], Actinia equina и Actinia tenebrosa [34], Heteractis magnijica [35]. Это, как правило, высокоосновные полипептиды с изоэлектрической точкой (pi) 9-12.
Характерной особенностью их аминокислотного состава является отсутствие остатков цистеина и высокое содержание основных и гидрофобных аминокислотных остатков. Токсичность актинопоринов, оцениваемая летальной дозой для мышей (ЛД5о), колеблется в пределах от 23 до 320 мкг/кг, что позволяет отнести их к высокотоксичным соединениям.
12
Таблица 1
Физико-химические характеристики актинопоринов некоторых видов актиний
Источник цитолизина
Молекулярная масса, кДа
мышах, мюткг
Pi
Гемолитическая
активность
(ГЕЛ1Г)
Actiniidae
Actinia cari [30]
каритоксин I 19.8 54 9.45 7.0x103
каритоксин II 19.8 91 10.0 5.8xlO3
Actinia
equina [34]
эквинатоксин I 19 23 9.8
эквинатоксин II 19 35 10.5
эквинатоксин III 19 83 10.5
Actinia tenebrosa
[34]
тенебросин-А 19.8 9.4 7.1xlO5
тенебросин-В 19.4 9.4 2.3xlO5
тенебросин-С 20.2 >10 1.7x105
Aliciidae
Phyllodiscus semoni
[38] PsTX-20A
1.25xlO4
Sagartiidae
Sagartia rosea [39] Srcl
19.6
4.8
1.1бхЮ3
Stichodactylidae
Heteractis magnifica [35] магнификализин I
19 140 9.4 3.6x104
магнификализин II 19 320 10.0 З.ЗхЮ4
Radianthus
macrodactylus [29]
RTX-A 20 50 9.8 3.5x104
RTX-S 20 50 9.8 1.0x104
RTX-G 20 100 10.5 5.0хЮ4
RTX-S II [32] 19.28 70 10 З.бхЮ4
Stichodactyla
helianthus [33]
цитолизин I 17.6 8.7 O.91xlO4
цитолизин II 17.6 9.5 3.14хЮ4
цитолизин III 17.5 100 9.7 4.82хЮ4
цитолизин IV 19.2 9.8 1.67x104
Актинопорины являются термолабильными полипептидами: с увеличением температуры от 40 до 60°С наблюдается уменьшение их гемолитической активности
[36]. Прединкубация этих полипептидов с экзогенным сфингомиелином (СМ) приводит к потере их гемолитической активности, поэтому они получили название сфингомиелинингибируемые цитолизины [37].
2.2.2.1. Первичная структура актинопоринов
В последнее десятилетие благодаря применению методов структурной химии белка и молекулярной биологии (расшифровка кодирующих аминокислотные последовательности полипептидов мРНК и кДНК) установлены полные первичные структуры десяти актинопоринов (рис. 4). Структуры восьми актинопоринов, EqtII, IV и V из A. equina [40, 41, 42], StI и StII из S. helianthus [43], HmgUI из Н. magnified [44], цитолизинов PsTX-20A из Phyllodiscus semoni [38] и Src I из Sagartia rosea [39], были установлены с помощью рекомбинантных ДНК (рис. 4). Показано, что зрелые полипептиды состоят из 175-179 аминокислотных остатков. Отмечена высокая степень гомологии //-концевых аминокислотных последовательностей для актинопоринов актиний, принадлежащих к двум различным семействам, Actiniidae и Stichodactylidae. Так для HmgUI, StI и StII, TnC и EqtII степень гомологии составила 91, 89, 65 и 63%, соответственно.
Рентгеноструктурный анализ кристаллических структур StII и EqtII показал, что iV-концевой фрагмент молекулы имеет сс-спиральную конфигурацию [45, 46]. Было высказано предположение, что именно этот участок молекулы проникает в липидный бислой при взаимодействии актинопорина с мембраной [47]. Интересной особенностью всех аминокислотных последовательностей всех известных актинопоринов является наличие триптофанобогащенного высококонсервативного участка (WYSNWW). Подобный участок присутствует также в структурах р-пороформирующих токсинов, таких как холестеринингибируемые цитолизины грамположительных бактерий, для которых было показано, что этот участок взаимодействует с липидным матриксом мембран [48].
Рис. 4. Множественное выравнивание аминокислотных последовательностей актинопоринов. Sti, StII: стихолизин I (код Genbank, P81662) и стихолизин II (код Genbank, P07845) из S. helianthus [43]. Hmglll, HMT: магнификализин III (код Genbank, Q9U6X1), магнификализин [44, 49] из Н. magnified. TenC: тенебросин С (код Genbank, Р17723) из A. tenebrosa [50]. EqtII, EqtIV, EqtV: эквинатоксин II (код Genbank, P17723), эквинатоксин IV (код Genbank, Q9Y1U9), эквинатоксин V (код Genbank, Q93109) из А. equine [40-42]. PsTX: актинопорин из P. semoni [38]. Srcl: кислый актинопорин из S. rosea [39]. Консенсус последовательностей представлен внизу. Идентичные аминокислотные остатки во всех последовательностях отмечены черным цветом. Выравнивание выполнено с помощью программы CLUSTALW [51].
В 2002 г. был впервые клонирован и экспрессирован актинопорин Src I из S. rosea (Anthozoa, Sagartiidae) (рис. 4), имеющий pi 4.8 и молекулярную массу 19600 Да [39]. При анализе аминокислотного состава и последовательностей Src I и EqtII оказалось, что EqtII содержит 14.4% основных аминокислот и 9.4% кислых аминокислот, тогда как Src I — 9.6% и 11.3%, соответственно. Сравнение первичной структуры кислого цитолизина Src I со структурами основных актинопоринов показало высокую степень гомологии (от 71 до 76%). Существенные отличия наблюдаются в количестве основных и кислых аминокислотных остатков в С-концевых фрагментах молекул. Было высказано предположение, что значение pi этих актинопоринов главным образом определяется аминокислотными остатками в С-концевом участке молекулы, так как именно этот фрагмент (60 аминокислотных остатков), по сравнению с остальной частью молекулы, обогащен или основными, или кислыми аминокислотами [39].
2.2.2.2. Вторичная и третичная структура актинопоринов
При исследовании актинопоринов методами КД- и ИК-спектроскопии обнаружено, что они являются р-структурированными полипептидами. Установлено, что StI и StII содержат 44-50% р-складчатых структур, 18-20% Р-изгибов, 12-15% а-спирали и 19-22% неупорядоченной структуры [52]. Эти результаты согласуются с данными рентгеноструктурного анализа EqtII, согласно которому он имеет 47.5% Р-складчатых структур, 9.5% а-спирали и 47.5% неупорядоченной структуры и Р-изгибов [45, 53].
Вторичная структура актинопоринов достаточно устойчива в большом интервале температур и рН. При рН ниже 1.1 и выше 10.0 или увеличении температуры выше 53°С EqtII и StII переходят в состояние расплавленной глобулы [54-57]. В интервале рН 7—10 происходит частичное развертывание структуры молекулы, которое характеризуется незначительным перераспределением в содержании элементов вторичной структуры [56, 57]. Как было показано ранее [58-60], именно в этом диапазоне рН гемолитическая активность актинопоринов максимальна. При рН 11 происходит полное разрушение
третичной структуры, увеличение нерегулярной спиральной структуры, что переводит актинопорин в водонерастворимое состояние [57].
Показано, что увеличение ионной силы раствора StI [60] и RTX-A [36] приводит к заметному увеличению его гемолитической активности. Этот эффект связан с частичным развертыванием молекулы полипептида в присутствии повышенной концентрации солей [56, 57], что также объясняет неспецифичное увеличение гемолитической активности, вызываемое ионами Са2+, Mg2+, Ba2+ и некоторыми другими двухвалентными катионами в концентрации выше 10 мМ для EqtII [58]. По-видимому, связывание актинопорина с липидной мембраной сопровождается конформационными изменениями его третичной структуры, без каких либо значительных изменений вторичной структуры полипептида.
Список литературы
Цена, в рублях:
(при оплате в другой валюте, пересчет по курсу центрального банка на день оплаты)
1425
Найти готовую работу
ЗАКАЗАТЬ
Обратная
связь:
Связаться
Вход для партнеров
Регистрация
Восстановить доступ
Материал для курсовых и дипломных работ
29.04.24
Результаты оценки психологических детерминант гражданской идентичности учащихся старших классов
29.04.24
Программа формирования гражданской идентичности старшеклассников
29.04.24
Психологические основания для разработки программы формирования гражданской идентичности старшеклассников
Архив материала для курсовых и дипломных работ
Ссылки:
Счетчики:
© 2006-2022. Все права защищены.
Выполнение уникальных качественных работ - от эссе и реферата до диссертации. Заказ готовых, сдававшихся ранее работ.